TMNT3 coloca mais foco no trabalho em equipe, desenvolvimento de personagens e controle do que qualquer outro jogo de console Turtles até o momento. Os jogadores podem jogar como seu Tartaruga favorito sozinho ou com até três amigos, ganhando pontos de experiência ao longo do caminho enquanto cortam e golpeiam Ninjas do Pé e chefes poderosos e bem conhecidos do universo TMNT. Esses pontos de experiência permitem que os jogadores melhorem e evoluam as características e habilidades de suas Tartarugas para ataques e movimentos mais variados e poderosos. O Sistema Ninja Scroll é outro novo recurso do TMMT3. Ser capaz de selecionar quais pergaminhos ninja usar permite que as Tartarugas usem várias habilidades especiais estrategicamente. O jogo cooperativo está no coração do TMNT3 e os jogadores que se juntam a amigos para a ação multijogador são recompensados com recursos exclusivos, como o Ataque Cooperativo, para causar ainda mais danos chocantes aos inimigos. O efeito deste ataque muda dependendo do número de jogadores trabalhando juntos (entre 2-4 jogadores). Para um controle ainda maior, o TMNT3 apresenta um novo sistema de combate chamado Target Attack, que permite que os jogadores joguem de forma mais instintiva e estratégica. Com o sistema de Ataque Alvo, os jogadores poderão travar em inimigos específicos e bloquear, esquivar ou contra-atacar de acordo para um combate mais suave e manobrável. O Modo História pode ser jogado com 1 a 4 jogadores. Mesmo quando você tem menos de 4 jogadores para jogar, as outras Tartarugas estarão ao seu lado, controladas por IA. Todas as Tartarugas podem participar do Ataque Cooperativo para derrotar os inimigos e os jogadores podem dar comandos à IA.

No Episódio 1, as tartarugas começam a salvar uma pessoa idosa na cidade de Nova York de Triceratons sádicos. Depois de destruir três portadores que implantaram o exército Triceraton, as tartarugas vão para o subsolo para chegar ao Central Park para resgatar seus amigos Casey e April. Enquanto estão no parque, Leo Raph Mikey e Don se defendem contra os Triceratons e o Professor Honeycutt, identificado como o Fugitoide salvo do Nexo de Batalha TMNT 2, ajuda as tartarugas a descobrir onde Casey Jones e April O'Neil são mantidos em cativeiro. Invadindo a base do Triceraton, Zaranmon, comandante-em-chefe do Triceraton, mobiliza um robô no esforço de parar as Tartarugas e Traximus. A tentativa de Zaranmon é um fracasso e Traximus destrói uma cadeira para fazer mudanças em seu clã. No Episódio 2, as tartarugas descobrem novas tecnologias vindas de Baxter Stockman enquanto Mousers se infiltram no esgoto causando dor intensa aos ouvidos do Mestre Splinter. Enquanto protegem seu sensei, as tartarugas ninjas estão se defendendo dos Mousers enquanto ficam perto dele. No entanto, Mestre Splinter acaba capturado e as tartarugas usam hovercraft para perseguir uma van em movimento. Eles logo são bloqueados por uma dupla inimiga alta e pequena para uma emboscada. Depois de passarem por eles, as tartarugas retomam sua missão de resgate para o Mestre Splinter, eventualmente lutando com Bishop e depois tendo que usar estrelas de arremesso para quebrar uma fechadura para libertá-lo. No Episódio 3, as Tartarugas encontram todos os membros do Clã do Pé através das missões. Hun, Karai e Oroku Saki, a identidade humana do Destruidor, todos caem nas mãos das tartarugas. Na batalha final com Saki, ele é atualizado como Mega Destruidor. As tartarugas ninjas o derrotam e são convocadas ao conselho de Utrom para um tribunal. Scherel, o Utrom que controla o corpo do Destruidor é acusado de crimes desonestos e é exilado para um planeta gelado, enquanto Karai e os outros são transformados nas autoridades quando o jogo principal termina. No capítulo Pesadelo, cada uma das tartarugas tem um sonho e encontra vários chefes. Limpar a maioria das missões neste capítulo leva ao chefe final do jogo, Ultimate Drako. Para usar os pergaminhos gembu para ativar as formas Ultimate Turtle, o jogador deve coletar pergaminhos e outros conteúdos no modo Batalha Livre.