Assassin's Creed III é um jogo de ação e aventura de mundo aberto ambientado principalmente na América Colonial do século XVIII durante a Revolução Americana. Os jogadores controlam dois personagens em toda a história: Haytham Kenway, um Templário britânico que opera durante a Guerra Franco-Indígena, e seu filho meio-mohawk Ratonhnhaké:ton (também conhecido como Connor), que se torna um Assassino. A jogabilidade ocorre em Boston, Nova York e em uma grande fronteira selvagem, com corrida livre, furtividade e combate usando armas, incluindo tomahawks, mosquetes, arcos e as Lâminas Ocultas da série. O jogo introduz o combate naval através da capitania de Connor em um navio de guerra, bem como a caça, um sistema de economia de propriedade e o clima sazonal que afeta a jogabilidade. Uma narrativa de enquadramento moderna segue Desmond Miles usando o Animus para reviver as memórias de seus ancestrais.

Em 1754, o templário britânico Haytham Kenway viaja para as colônias americanas para localizar um antigo templo para sua Ordem. Ele recruta aliados e se apaixona por uma mulher moicana chamada Kaniehti:io enquanto elimina um associado desonesto. Anos mais tarde, seu filho Ratonhnhaké:ton testemunha a morte de sua mãe durante um ataque à sua aldeia e cresce para se tornar o Assassino conhecido como Connor, treinado pelo Assassino aposentado Achilles Davenport. Connor é atraído para a Revolução Americana enquanto caça os Templários Coloniais, que incluem seu próprio pai. Ao longo de duas décadas, Connor elimina os aliados de Haytham, descobre que a morte de sua mãe foi ordenada por George Washington, e não pelos Templários, e acaba sendo forçado a confrontar e matar o próprio Haytham. Nos dias modernos, Desmond Miles usa as memórias de Connor para localizar uma chave que abre as câmaras internas de um templo precursor, sacrificando-se para ativar um dispositivo que protege a Terra de uma explosão solar catastrófica.