Batman: Arkham City baseia-se na base intensa e atmosférica de Batman: Arkham Asylum, enviando os jogadores para Arkham City, a nova "casa" de segurança máxima para todos os bandidos, gangsters e mentores criminosos insanos de Gotham City. Situado dentro das muralhas fortemente fortificadas de um distrito extenso no coração de Gotham City, esta sequência altamente antecipada apresenta uma nova história que reúne um novo elenco de estrelas de personagens clássicos e vilões assassinos do universo Batman, bem como uma vasta gama de novos e recursos de jogabilidade aprimorados para oferecer a melhor experiência como o Cavaleiro das Trevas.

Em uma conferência de imprensa realizada por Bruce Wayne para declarar sua oposição a Arkham City, os mercenários TYGER o prendem e aprisionam em Arkham City. Hugo Strange revela seu conhecimento da dupla identidade de Wayne como Batman antes de libertá-lo para a população criminosa da prisão. Enquanto Strange se prepara para iniciar o "Protocolo 10", Wayne obtém seu equipamento via airdrop de Alfred Pennyworth, permitindo que ele se torne Batman. Ele primeiro salva a Mulher-Gato de ser executada por Duas-Caras, que espera ganhar respeito assassinando-a. Depois que o Coringa tenta assassinar a Mulher-Gato, Batman o rastreia até seu esconderijo na Sionis Steelmill, acreditando que o Coringa pode saber a verdade por trás do Protocolo 10. Lá, Batman descobre que as propriedades instáveis da fórmula Titã estão se transformando no sangue do Coringa, matando-o gradualmente. O Coringa captura Batman e realiza uma transfusão de sangue nele, infectando-o com a mesma doença fatal. O Coringa também revela que os hospitais de Gotham foram envenenados com seu sangue infectado. Desesperado para salvar a si mesmo e a cidadãos inocentes, Batman procura o Sr. Frio, que estava desenvolvendo uma cura, mas desde então foi sequestrado pelo Pinguim. Rastreando o Pinguim até o Instituto Nacional de História Cyrus Pinkney, Batman derrota suas forças, seu monstro aprisionado Solomon Grundy e, finalmente, o próprio Pinguim, antes de libertar o Sr. Frio. Freeze diz a Batman que ele já desenvolveu a cura, mas sua instabilidade a torna inútil. Batman deduz que as propriedades restauradoras do sangue de Ra's al Ghul podem completar a cura. Batman rastreia um dos assassinos de Ra's al Ghul até seu covil subterrâneo, levando Batman a um confronto com Ra's e sua filha Talia, ex-amante de Batman. Com o sangue de Ra's al Ghul, Freeze é capaz de desenvolver um antídoto, mas é roubado por Harley Quinn antes que Batman possa usá-lo. Quando ele retorna ao Coringa, Batman o encontra recuperado. Enquanto os dois lutam, Strange ativa o Protocolo 10, que é revelado como um esquema para acabar com toda a população de Arkham City e destruir o elemento criminoso de Gotham. As tropas TYGER começam a executar os presos enquanto Strange lança ataques de mísseis contra os habitantes de Arkham de sua base na Torre Maravilha. Um míssil atinge a siderúrgica, enterrando Batman sob os escombros. Antes que o Coringa possa tirar proveito da situação, Talia chega e lhe oferece a imortalidade em troca de poupar a vida de Batman. Depois de escapar com a ajuda da Mulher-Gato, Batman é convencido por Alfred a acabar com o Protocolo 10 antes de perseguir Talia e o Coringa. Batman se infiltra na Torre Maravilha e desativa o Protocolo 10. Ra's al Ghul é revelado como o verdadeiro cérebro por trás de Arkham City e fere mortalmente Strange por não derrotar Batman. Com seu último suspiro, Estranho ativa o "Protocolo 11", a autodestruição da Torre Maravilha. Batman e Ra's escapam, mas Ra's comete suicídio em vez de arriscar a captura. O Coringa contata Batman, ameaçando matar Talia a menos que Batman o encontre no Teatro Monarca. Assim que Batman chega, o Coringa exige a cura, mas é esfaqueado e aparentemente morto por Talia enquanto está distraído. Talia admite ter roubado a cura de Quinn, quando é morta por um segundo Coringa, ainda acometido pela doença. O Coringa saudável que Talia esfaqueou então reanima no Cara-de-Barro metamorfo, que se revela ter se disfarçado como um Coringa saudável o tempo todo a pedido do vilão doente. Batman incapacita Cara-de-Barro, mas o Coringa explode o chão do teatro, fazendo com que Batman caia no covil de Ra's abaixo. Batman destrói o rejuvenescedor Poço de Lázaro de Ra's antes que o Coringa possa usá-lo e bebe uma parte do antídoto. Batman debate a cura de seu inimigo, mas é atacado pelo Coringa antes que ele possa agir, fazendo com que o frasco de antídoto se esmague inadvertidamente. Batman admite que, apesar de tudo o que o Coringa fez, ele o teria salvado. Depois que o Coringa finalmente sucumbe à sua doença e morre, Batman carrega seu corpo para fora de Arkham City. Quando o Comissário Gordon pergunta o que aconteceu, Batman coloca o corpo do Coringa no capô de um carro da polícia e sai em silêncio.