Uma pista de 400 anos no caixão de Sir Francis Drake coloca um caçador de fortunas moderno em uma exploração do lendário tesouro de El Dorado, levando à descoberta de uma ilha esquecida no meio do Oceano Pacífico. A busca se torna mortal quando Nathan Drake fica preso na ilha e é caçado por mercenários. Em menor número e com menos armas, Drake e seus companheiros devem lutar para sobreviver enquanto começam a desvendar os terríveis segredos escondidos na Ilha.

O caçador de tesouros Nathan "Nate" Drake (Nolan North), acompanhado pela repórter Elena Fisher (Emily Rose), recupera o caixão do seu autoproclamado antepassado Sir Francis Drake, tendo-o localizado a partir de coordenadas inscritas numa relíquia de família: um anel que Nate usa à volta do pescoço. O caixão contém o diário de Sir Francis Drake, que dá a localização de El Dorado. Piratas atacam e destroem o barco de Nate, mas o amigo e mentor de Nate, Victor "Sully" Sullivan (Richard McGonagle), resgata os dois em seu hidroavião. Temendo que as reportagens de Elena atraíssem rivais em potencial, Nate e Sully a abandonam em uma doca. Seguindo o diário até o local indicado, Nate e Sully descobrem uma alcova que já abrigou uma grande estátua e percebem que El Dorado não é uma cidade, mas sim um ídolo de ouro. Eles encontram um submarino nazista, que contém uma página do diário de Drake mostrando que a estátua foi levada para uma ilha. No entanto, mercenários liderados pelo criminoso Gabriel Roman (Simon Templeman) e seu tenente Atoq Navarro (Robin Atkin Downes) interceptam Nate e Sully. Sully é aparentemente morto por um tiro no peito, mas Nate consegue escapar, encontra Elena e voa com ela para a ilha. No caminho, o fogo antiaéreo força Elena e Nate a socorrer e eles são separados. Depois de recuperar suprimentos do hidroavião destruído, Nate segue em direção a um antigo forte para encontrar Elena. Brevemente capturada por piratas liderados pelo velho associado Eddy Raja (James Sie), Elena liberta Nate e eles fogem para a antiga alfândega da ilha. Depois de encontrar registros mostrando que a estátua foi movida para o interior, eles descobrem que Sully está vivo e acompanhando Roman e Raja. Nate e Elena encontram e resgatam Sully que, tendo sobrevivido devido ao diário de Drake bloquear a bala, explica que estava ganhando tempo para Nate dando desinformação a Roman.